نظارت بر سلامت اندامهای جامد پس از پیوند با استفاده از DNA بدون سلول

تشخیص مبتنی بر cfDNA می تواند بیوپسی بافت را منسوخ کند
Costly and invasive tissue biopsies to detect allograft rejection after transplantation have numerous limitations. بیوپسی بافت پرهزینه و تهاجمی برای تشخیص رد آلوگرافت پس از پیوند محدودیت های بسیاری دارد. Assays based on cell-free DNA (cfDNA)—circulating fragments of DNA released from cells, tissues, and organs as they undergo natural cell death—have been intensively studied recently and could ultimately improve our ability to detect rejection, implement earlier changes in management, and even enhance the long-term survival of transplanted organs. سنجش های مبتنی بر DNA عاری از سلول (cfDNA) - قطعه های گردشی DNA که از سلول ها ، بافت ها و اندام هایی آزاد می شوند و در اثر مرگ سلول های طبیعی قرار می گیرند - اخیراً مورد مطالعه قرار گرفته اند و در نهایت می توانند توانایی ما در تشخیص رد را بهبود بخشند ، تغییرات قبلی را در مدیریت اعمال کنیم ، و حتی بقای بلند مدت اندام های پیوند یافته را تقویت کنید.
CfDNA assays that circumvent the need for whole-genome sequencing (WGS) and the need for a priori knowledge of donor and/or recipient genotypes have powerful logistical advantages and are currently under clinical scrutiny. CfDNA سنجش می کند که نیاز به ترتیب توالی کل ژنوم (WGS) و نیاز به دانش قبلی از ژنوتیپ های اهدا کننده و یا گیرنده را برطرف می کند ، دارای مزایای لجستیک قدرتمندی هستند و در حال حاضر تحت نظارت بالینی قرار دارند. In addition, improving knowledge of the organ-specific kinetics of donor-derived cfDNA (dd-cfDNA) following transplantation has also helped optimize these assays. علاوه بر این ، بهبود دانش سینتیک اختصاصی اندام از cfDNA مشتق از اهدا کننده (dd-cfDNA) پس از پیوند نیز به بهینه سازی این روش کمک کرده است. Laboratories also have introduced alternative methods for quantifying dd-cfDNA, such as digital droplet polymerase chain reaction (PCR) and organ-specific DNA methylation patterns. آزمایشگاهها روشهای جایگزین دیگری نیز برای تعیین کمیت dd-cfDNA مانند واکنش زنجیره ای پلیمراز قطرات دیجیتال (PCR) و الگوهای متیلاسیون DNA ویژه ارگان ها ارائه داده اند. As such, the field of minimally invasive diagnostics based upon cfDNA is increasingly promising, one day potentially replacing traditional tissue biopsies. به این ترتیب ، زمینه تشخیص حداقل تهاجمی مبتنی بر cfDNA به طور فزاینده ای امیدوار کننده است ، یک روز بطور بالقوه جایگزین بیوپسی بافت های سنتی.
نقش CFDNA در رد ارگان
Rejection, referring to injury of a donated organ caused by the recipient's immune system, can cause allograft dysfunction and even patient death. رد با اشاره به آسیب دیدگی ارگان اهدا شده ناشی از سیستم ایمنی گیرنده ، می تواند باعث اختلال در عملکرد آلوگرافت و حتی مرگ بیمار شود. T-cell mediated acute cellular rejection (ACR) occurs most often within the first 6 months post-transplant (1). رد سلول حاد واسطه سلول T (ACR) اغلب در 6 ماه اول پس از پیوند (1) رخ می دهد. ACR involves accumulation of CD4+ and CD8+ T-cells in the interstitial space of the allograft as the recipient's immune system recognizes antigens on the donated organ as foreign. ACR شامل تجمع سلولهای T4 CD4 و CD8 در فضای بینابینی آلوگرافت است زیرا سیستم ایمنی گیرنده آنتی ژن های موجود در بدن را به عنوان خارجی می شناسد. These T-cells initiate an immune cascade that ultimately leads to programmed cell death (apoptosis) of the targeted cells. این سلولهای T یک آبشار ایمنی را آغاز می کنند که در نهایت منجر به مرگ سلولی برنامه ریزی شده (آپوپتوز) سلولهای هدفمند می شود. As these cells die, genomic DNA is cleaved and fragments of dd-cfDNA, measuring approximately 140 base pairs (bp) in length, are released to join the pool of recipient cfDNA in the blood and ultimately excreted in the urine (2). با مرگ این سلول ها ، DNA ژنومی شکسته می شود و قطعات dd-cfDNA با اندازه گیری تقریبا 140 جفت پایه (bp) طول ، برای پیوستن به استخر گیرنده cfDNA در خون و در نهایت در ادرار دفع می شود (2).
Circulating cfDNA has recently been leveraged as a diagnostic tool to replace invasive biopsies in other areas of medicine, including analyzing fetal DNA fragments within the maternal circulation to identify genetic abnormalities in utero and sequencing circulating DNA released from tumor cells to identify cancer-related mutations. گردش cfDNA به تازگی به عنوان یک ابزار تشخیصی برای جایگزینی بیوپسی های تهاجمی در مناطق دیگر پزشکی ، از جمله تجزیه و تحلیل قطعات DNA جنین در گردش مادر برای شناسایی ناهنجاری های ژنتیکی در رحم و تعیین توالی در گردش DNA منتشر شده از سلول های تومور برای شناسایی جهش های مرتبط با سرطان ، استفاده شده است. In both these cases as well as in transplantation, high-throughput sequencing that identifies and quantifies DNA sequence differences distinguishes between the two different populations of cfDNA derived from distinct sources (2). در هر دو مورد و همچنین در پیوند ، توالی توان بالا که تفاوت توالی DNA را شناسایی و کمیت می کند بین دو جمعیت مختلف cfDNA حاصل از منابع مجزا تمایز قائل می شود (2). Three characteristics of cfDNA make it an excellent noninvasive candidate biomarker to detect rejection after solid organ transplantation: It can be obtained from a simple blood draw, its concentration accurately measured, and its nucleotide sequence easily identified. سه ویژگی cfDNA آن را به عنوان یک نشانگر نشان دهنده غیر تهاجمی عالی برای تشخیص رد پس از پیوند عضو جامد می سازد: می توان از یک ترسیم ساده خون ، غلظت آن به طور دقیق اندازه گیری و توالی نوکلئوتید آن به راحتی مشخص شد. Using cfDNA as a biomarker for ACR is also advantageous since it is derived from the injured cells of the donated organ and therefore should represent a direct measure of cell death occurring in the allograft. استفاده از cfDNA به عنوان نشانگر زیست محیطی برای ACR نیز فایده دارد زیرا از سلولهای آسیب دیده اندام اهدا شده گرفته می شود و بنابراین باید یک اندازه گیری مستقیم از مرگ سلولی باشد که در آلوگرافت اتفاق می افتد. Furthermore, cfDNA maintains all of the genetic features of the original genomic DNA, allowing the genetic material released from the donated organ to be differentiated from the cfDNA derived from cells of the recipient that are undergoing natural apoptosis (3). علاوه بر این ، cfDNA تمام ویژگیهای ژنتیکی DNA ژنومی اصلی را حفظ می کند ، و به این ترتیب ماده ژنتیکی که از اندام اهدا شده آزاد می شود ، از cfDNA حاصل از سلولهای گیرنده که تحت آپوپتوز طبیعی قرار می گیرند ، تمایز می یابد (3).
Frequent and accurate monitoring of allograft health is essential for transplant recipients' long-term survival. نظارت مکرر و دقیق از سلامت آلوگرافت برای بقای طولانی مدت دریافت کنندگان پیوند ضروری است. For heart transplantation (HT), endomyocardial biopsy (EMB) is the current gold standard for detecting ACR (4). برای پیوند قلب (HT) ، بیوپسی اندومیوکارد (EMB) استاندارد طلای فعلی برای تشخیص ACR (4) است. However, EMBs are costly with significant limitations, many of which are common to all organ biopsies (5-7). با این حال ، EMB با محدودیت های قابل توجهی پر هزینه هستند ، که بسیاری از آنها برای کلیه بیوپسی اندام ها مشترک است (5-7). Moreover, the invasive nature of EMBs puts HT patients at risk for complications (6,8,9). علاوه بر این ، ماهیت تهاجمی EMB ، بیماران HT را در معرض خطر عوارض قرار می دهد (6،8،9).
Unfortunately, currently available noninvasive methods including echocardiography or magnetic resonance imaging (MRI) lack sufficient specificity and sensitivity to reliably detect rejection (10-13). متأسفانه ، روشهای غیر تهاجمی موجود در حال حاضر از جمله اکوکاردیوگرافی یا تصویربرداری با رزونانس مغناطیسی (MRI) فاقد ویژگی و حساسیت کافی برای تشخیص قابل اعتماد رد هستند (13-13). Blood-based biomarkers, such as cfDNA, represent a promising alternative that could be readily implemented into clinical practice (14-17). نشانگرهای زیستی مبتنی بر خون ، مانند cfDNA ، جایگزین امیدوار کننده ای است که می تواند به راحتی در عمل بالینی اجرا شود (14-17).
KINETICS CFDNA در طول QUISCENCE و رد
Since cfDNA originates from the naturally occurring process of apoptosis, all individuals have detectable levels of cfDNA in their blood (18). از آنجا که cfDNA ناشی از روند طبیعی آپوپتوز است ، همه افراد سطوح قابل تشخیص cfDNA را در خون خود دارند (18). For healthy individuals, the majority of circulating cfDNA comes from hematopoietic cells that have undergone natural death related to cellular turnover. برای افراد سالم ، اکثر cfDNA در گردش خون ناشی از سلولهای خونساز است که در اثر مرگ و میر سلولی دچار مرگ طبیعی شده اند. Levels of cfDNA fluctuate for multiple reasons including infection, surgery, trauma, or even exhaustive exercise (2,19). سطوح cfDNA به دلایل مختلفی از جمله عفونت ، جراحی ، تروما یا حتی ورزشهای جامع (2،19) در نوسان است. Therefore, developing a cfDNA-based assay to detect rejection requires assessing the expected kinetics of dd-cfDNA release into the recipient's circulation post-transplant. بنابراین ، توسعه یک روش مبتنی بر cfDNA برای تشخیص رد ، نیاز به ارزیابی سینتیک مورد انتظار انتشار dd-cfDNA در گردش خون گیرنده پس از پیوند دارد. This consideration is especially important since the release of dd-cfDNA over time post-transplant is organ-specific (20-22). این توجه به خصوص مهم است از آنجا که انتشار dd-cfDNA با گذشت زمان پس از پیوند ، مخصوص اعضای بدن است (20-22).
For example, at 1 day post-HT the average level of dd-cfDNA is 3.8 ± 2.3% (20). به عنوان مثال ، در یک روز پس از HT ، میانگین سطح dd-cfDNA برابر 2.3 ± 3.8 ((20) است. However, by 7 days the level of dd-cfDNA has declined rapidly and remains consistently low (<1%). با این حال ، تا 7 روز سطح dd-cfDNA به سرعت کاهش یافته است و به طور مداوم کم باقی مانده است (<1). During an episode of acute rejection in the heart, the level of dd-cfDNA was found to increase to 4%–5% from a baseline of about 0.06% observed during quiescence. در طی یک قسمت از رد حاد در قلب ، سطح dd-cfDNA به میزان 4/5 from از یک پایه در حدود 0.06 observed مشاهده شد که در طول ساکتشن مشاهده می شود. The kinetics of dd-cfDNA observed in the circulation of HT recipients was similar to that observed after renal transplantation (22). سینتیک dd-cfDNA مشاهده شده در گردش گیرندگان HT مشابه موارد مشاهده شده پس از پیوند کلیه بود (22).
In contrast, recipients of bilateral lung transplants were found to have an average dd-cfDNA fraction of 26 ± 14% on the first postoperative day. در مقابل ، دریافت کنندگان پیوند دو طرفه ریه به طور متوسط ​​کسر dd-cfDNA از 14 ± 26 on در اولین روز بعد از عمل پیدا شد. Furthermore, the reduction in dd-cfDNA was characterized by levels of dd-cfDNA that declined rapidly within the first week but then slowed and generally remained at 1%–3% (21). علاوه بر این ، کاهش در df-cfDNA با سطح dd-cfDNA مشخص شد که به سرعت در هفته اول کاهش یافته اما پس از آن کند شده و به طور کلی در 1 – -3 remained باقی مانده است (21). However, similar to heart and kidney transplants during an episode of acute rejection, the level of dd-cfDNA increased significantly, climbing to an average of 14%–15%. با این حال ، شبیه به پیوند قلب و کلیه در طی یک قسمت از رد حاد ، سطح dd-cfDNA به طور قابل توجهی افزایش یافته است ، به طور متوسط ​​به 14 – -15 ing صعود.
Differences in tissue mass and rates of cellular turnover account for this variability in the levels of dd-cfDNA released early post-transplant and during quiescence. تفاوت در توده بافت و میزان گردش خون سلولی این تغییرپذیری در سطح dd-cfDNA منتشر شده پس از پیوند اولیه و در طول ساکتشن را نشان می دهد. For example, differences in circulating dd-cfDNA levels in quiescent bilateral and single-lung transplants can be explained by the difference in cellular turnover, being 107 vs. 58 cells/second, respectively (21). به عنوان مثال ، تفاوت در گردش سطح dd-cfDNA در پیوندهای دو طرفه و تک ریه خاموش می تواند با تفاوت در گردش مالی سلولی ، به ترتیب 107 در مقابل 58 سلول در ثانیه توضیح داده شود (21). By contrast, in a quiescent transplanted heart, the cellular turnover rate is only 8 cells/second (21-23). در مقابل ، در یک قلب پیوند خاموش ، سرعت گردش سلولی تنها 8 سلول در ثانیه است (21-23). Thus, an understanding of the expected levels of dd-cfDNA associated with a given solid organ is essential to facilitate development of organ-specific assays that detect rejection. بنابراین ، درک سطح مورد انتظار از dd-cfDNA مرتبط با یک اندام جامد داده شده برای تسهیل توسعه سنجش های خاص اندام که تشخیص رد می دهد ضروری است. Once the kinetics of cfDNA release for a particular organ are understood, several methods exist for quantifying the relative amount of dd-cfDNA. هنگامی که سینتیک انتشار cfDNA برای یک اندام خاص درک شود ، چندین روش برای تعیین مقدار نسبی dd-cfDNA وجود دارد.
STRATEGIES TO DISTINGUISH RECIPIENT- VS. استراتژی های مورد استفاده در مورد توزیع در مقابل DONOR-DERIVED CFDNA CFDNA DONOR DERIVED
عدم تطابق جنسی-گیرنده-گیرنده
For organ transplants in which the donor is male and the recipient is female, laboratories can leverage this sex mismatch to calculate dd-cfDNA levels from within the recipient's total cfDNA pool (17). در مورد پیوند عضو که اهدا کننده آن مرد است و گیرنده آن زن است ، آزمایشگاه ها می توانند برای عدم محاسبه سطح dd-cfDNA از کل استخر cfDNA گیرنده (17) ، این عدم تطابق جنسی را اعمال کنند. Researchers first demonstrated the feasibility of this approach in urine samples taken from female renal transplant recipients who had received a kidney from male donors and when they experienced rejection demonstrated elevated levels of dd-cfDNA in their urine that specifically contained regions found on the Y chromosome (17). محققان برای اولین بار امکان سنجش این روش را در نمونه های ادرار گرفته شده از دریافت کنندگان پیوند کلیه زنانی که کلیه اهدا کنندگان مرد دریافت کرده بودند نشان دادند و هنگامی که رد آنها را تجربه کردند سطح بالایی از dd-cfDNA را در ادرار خود نشان دادند که به طور خاص نواحی یافت شده در کروموزوم Y ( 17) Although this approach allows for confident diagnosis of rejection in the allograft, sex-mismatch between the donor and recipient is relatively infrequent and not universally applicable. اگرچه این روش امکان تشخیص مطمئن از رد در آلوگرافت را فراهم می کند ، اما عدم تطابق جنسی بین اهدا کننده و گیرنده نسبتاً نادر است و از نظر جهانی کاربرد ندارد.
تفاوت توالی DNA دهنده یا گیرنده
An organ transplant can also be regarded as a genome transplant, as the cells within a transplanted organ contain the genetic information of its donor. پیوند عضو همچنین می تواند به عنوان پیوند ژنوم در نظر گرفته شود ، زیرا سلول های موجود در اندام پیوند شده حاوی اطلاعات ژنتیکی اهدا کننده آن هستند. As such, the concept of genome transplant dynamics (GTD) relies on the presence of genetic differences between the donor and recipient at a particular locus, which then can be leveraged to identify the origin of the circulating cfDNA (20-24). به این ترتیب ، مفهوم پویایی پیوند ژنوم (GTD) به وجود تفاوتهای ژنتیکی بین اهدا کننده و گیرنده در یک مکان خاص متکی است ، که از این طریق می توان برای شناسایی منشأ cfDNA در گردش (20-24) استفاده کرد. Ideally, the recipient would be homozygous for a single base (for example, AA) and at the same locus the donor would be homozygous for a different base (for example, GG). در حالت ایده آل ، گیرنده برای یک پایه واحد (به عنوان مثال AA) هموزیگوس خواهد بود و در همان مکان اهدا کننده برای یک پایگاه متفاوت (به عنوان مثال GG) هموزیگوت خواهد بود.
Given the genetic heterogeneity between individuals, tens of thousands of potentially informative loci across the genome can be interrogated using high-throughput sequencing to distinguish dd-cfDNA from recipient cfDNA (20,24). با توجه به ناهمگونی ژنتیکی بین افراد ، ده ها هزار نفر از مکانهای آموزنده بالقوه در ژنوم را می توان با استفاده از توالی با توان بالا برای تمایز dd-cfDNA از cfDNA دریافت کننده مورد بازجویی قرار داد. This concept was first illustrated using banked samples from cardiac donors to obtain a priori donor genotypes for each donor-recipient pairing. این مفهوم برای اولین بار با استفاده از نمونه های بانکی از اهدا کنندگان قلب نشان داده شد تا ژنوتیپ اهدا کننده پیشینی برای هر جفت کننده گیرنده دهنده دریافت شود. After extracting and sequencing cfDNA from each recipient, the fraction of donor-specific molecules was determined. پس از استخراج و تعیین توالی cfDNA از هر گیرنده ، کسری از مولکولهای خاص اهدا کننده مشخص شد. In samples taken during or immediately preceding a biopsy-proven rejection event, the proportion of donor-specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) was found to have increased from <1% to >3%–4% (24). در نمونه های گرفته شده در طول یا بلافاصله قبل از یک رویداد رد اثبات بیوپسی ، نسبت چند پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی تک دهنده دهنده (SNPs) مشخص شد که از <1 to به> 3 – -4 increased (24) افزایش یافته است.
This early retrospective study has now been validated prospectively. این مطالعه گذشته نگر گذشته است و اکنون به صورت آینده نگر تأیید شده است. Adult and pediatric heart and lung transplant recipients were recruited and genotypes for each donor-recipient pair were obtained through WGS with an average of 53,423 informative SNP markers identified (20). گیرندگان پیوند قلب و ریه در بزرگسالان و کودکان استخدام شدند و ژنوتیپ ها برای هر جفت گیرنده دهنده از طریق WGS با میانگین 53423 نشانگر SNP آموزنده شناسایی شد (20). Overall, early detection of acute rejection was superior to that of AlloMap, the first Food and Drug Administration-approved non-invasive approach to detecting ACR after HT based on transcriptome analysis (25). به طور کلی ، تشخیص زود هنگام رد حاد نسبت به AlloMap ، اولین روش غیر تهاجمی تأیید شده توسط سازمان غذا و داروی برای تشخیص ACR پس از HT بر اساس تجزیه و تحلیل رونوشت برتری داشت (25).
Research also has shown that WGS not only provides information about a graft but also a patient's virome and overall state of immunosuppression. تحقیقات همچنین نشان داده اند که WGS نه تنها اطلاعاتی در مورد پیوند بلکه ویروس بیمار و حالت کلی سرکوب سیستم ایمنی را ارائه می دهد. This represents a potentially great advantage unobtainable by other assays (26-28). این نمایانگر یک مزیت بالقوه بزرگ است که توسط سایر سنجش ها غیرقابل دستیابی است (26-28).
However, WGS faces challenges that could prevent it from being implemented routinely in clinical practice. با این حال ، WGS با چالش هایی روبرو است که می تواند مانع از اجرای آن به طور عادی در عمل بالینی شود. For example, while a recipient's genetic information can be easily obtained, this is not always true for a donor. به عنوان مثال ، در حالی که می توان اطلاعات ژنتیکی یک گیرنده را به راحتی بدست آورد ، این همیشه برای اهدا کننده صادق نیست. Moreover, WGS is costly, labor intensive, and time-consuming. علاوه بر این ، WGS پرهزینه ، پر کار و وقت گیر است.
An alternative method employs a panel of genotyped polymorphic SNPs identified within the pool of extracted cfDNA thereby eliminating the need for a priori knowledge of a donor's specific genotype (29). یک روش جایگزین از پنل SNP های پلیمورفیک ژنوتیپ شده شناسایی شده در استخر cfDNA استخراج شده استفاده می کند و در نتیجه نیاز به دانش قبلی از ژنوتیپ خاص یک اهدا کننده را از بین می برد (29). Unlike kidney and liver transplants, which often occur between closely related individuals, the donor-recipient pairs for heart and lung transplants typically are not related. بر خلاف پیوند کلیه و کبد ، که اغلب بین افراد نزدیک به هم اتفاق می افتد ، جفت گیرنده دهنده برای پیوند قلب و ریه به طور معمول ارتباطی ندارند. GTD requires genotyping of both the transplant recipient and donor. GTD نیاز به ژنوتیپ دریافت کننده پیوند و اهدا کننده دارد. However, in practice, donor genotype information is often unavailable. با این حال ، در عمل ، اطلاعات ژنوتیپ اهدا کننده غالباً در دسترس نیست. Here, we address this issue by developing an algorithm that estimates dd-cfDNA levels in the absence of a donor genotype. در اینجا ، ما با ایجاد الگوریتمی که سطح dd-cfDNA را در صورت عدم وجود ژنوتیپ اهدا کننده ، تخمین زده می شود ، به این مسئله پرداختیم. Our algorithm predicts heart and lung allograft rejection with an accuracy that is similar to conventional GTD. الگوریتم ما رد آلوگرافت قلب و ریه را با دقتی مشابه GTD معمولی پیش بینی می کند. We furthermore refined the algorithm to handle closely related recipients and donors, a scenario that is common in bone marrow and kidney transplantation. علاوه بر این ، الگوریتم را برای مقابله با دریافت کنندگان و اهدا کنندگان نزدیک ، تصحیح کردیم ، سناریویی که در مغز استخوان و پیوند کلیه مشترک است. We show that it is possible to estimate dd-cfDNA in bone marrow transplant patients who are unrelated or who are siblings of the donors, using a hidden Markov model. ما نشان می دهد که ممکن است با استفاده از یک مدل مارکوف پنهان ، تخمین dd-cfDNA در بیماران پیوند مغز استخوان که بی ارتباط هستند یا خواهر و برادر اهدا کنندگان هستند ، تخمین زده شود. Therefore, algorithms have been developed for heart and lung transplants which assume that the donor's genotype occurs at the same frequency as the general population. بنابراین ، الگوریتم هایی برای پیوند قلب و ریه ایجاد شده اند که فرض می کنند ژنوتیپ اهدا کننده در همان فرکانس همانند جمعیت عمومی رخ می دهد. Based on these frequencies and comparison to the known genotype of the recipient, the fraction of dd-cfDNA can be reliably estimated from the total pool of cfDNA isolated from a recipient's plasma sample. براساس این فرکانسها و مقایسه آن با ژنوتیپ شناخته شده گیرنده ، می توان کسری از dd-cfDNA را از کل استخر cfDNA جدا شده از نمونه پلاسما گیرنده برآورد کرد.
In the case of lung transplantation, this single-genome model, when compared to the methodology using both donor and recipient genotypes, was found to provide comparable fractions of dd-cfDNA. در مورد پیوند ریه ، این مدل تک ژنوم ، هنگامی که با روش استفاده از هر دو ژنوتیپ دهنده و گیرنده مقایسه شد ، یافت شد که کسری قابل مقایسه ای از dd-cfDNA را ارائه می دهد. However, when researchers applied this same algorithm to HT, the estimated levels of dd-cfDNA were not as strongly correlated as in lung transplants. با این حال ، هنگامی که محققان از این الگوریتم مشابه برای HT استفاده کردند ، سطح تخمین زده شده از dd-cfDNA به همان اندازه در پیوندهای ریه ارتباطی ندارد. This might be related to the lower absolute amounts of dd-cfDNA present after HT. این ممکن است به مقدار مطلق پایین dd-cfDNA موجود پس از HT مربوط باشد. This is another example of organ-specific cfDNA kinetics that can influence assay results and must be taken into account (30). این نمونه دیگری از سینتیک cfDNA اختصاصی اندام است که می تواند نتایج آزمایش را تحت تأثیر قرار دهد و باید در نظر گرفته شود (30).
In the case of renal transplantation, prospective studies have been conducted to ascertain the utility of dd-cfDNA levels, identified using known donor-specific SNPs, as a viable marker for rejection. در مورد پیوند کلیه ، مطالعات آینده نگر برای مشخص شدن کاربرد سطوح dd-cfDNA ، با استفاده از SNP های اختصاصی اهداکننده شناخته شده ، به عنوان یک نشانگر مناسب برای رد انجام شده است. In one such study, 384 kidney recipients were recruited from 14 clinical sites to provide blood samples at scheduled intervals and at times of clinically indicated biopsies (31). در یک مطالعه چنین ، 384 گیرنده کلیه از 14 سایت بالینی برای تهیه نمونه خون در فواصل زمانی برنامه ریزی شده و در زمان های بیوپسی بالینی نشان داده شده استخدام شدند (31). Overall, the study focused on the correlation between the histology in 107 biopsy specimens from 102 patients and the levels of dd-cfDNA found in matched plasma samples. به طور کلی ، این مطالعه به همبستگی بین بافت شناسی در 107 نمونه بیوپسی از 102 بیمار و سطح dd-cfDNA موجود در نمونه های پلاسمائی همسان متمرکز شده است. More specifically, 27 biopsy samples from 27 patients with active rejection were obtained along with 80 biopsy samples from 75 patients without active rejection. به طور خاص ، 27 نمونه بیوپسی از 27 بیمار با رد فعال همراه با 80 نمونه بیوپسی از 75 بیمار بدون رد فعال دریافت شد.
In this study, active rejection included acute antibody-mediated rejection (AMR), chronic AMR, and ACR. در این مطالعه ، رد فعال شامل رد حاد آنتی بادی (AMR) ، AMR مزمن و ACR بود. The assay used in this study employed a 1% cutoff for the fraction of dd-cfDNA to indicate the presence or absence of active rejection and was found to have 85% specificity (95% CI, 79%–91%) and 59% sensitivity (95% CI, 44%–74%). سنجش مورد استفاده در این مطالعه ، قطع 1٪ برای کسری از dd-cfDNA را نشان می دهد که وجود یا عدم وجود رد فعال را نشان می دهد و 85٪ ویژگی (95٪ CI ، 79٪ -91٪) و حساسیت 59٪ را نشان می دهد. (95٪ CI ، 44٪ -74٪). The sensitivity of this assay was greater for discriminating between active and absent AMR, as the use of a cutoff of 1% dd-cfDNA was found to have an 83% specificity (95% CI, 78%–89%) and 81% sensitivity (95% CI, 67%–100%). حساسیت این روش برای تمایز بین AMR فعال و غایب بیشتر بود ، زیرا استفاده از قطع 1٪ dd-cfDNA دارای ویژگی 83٪ (CI 95٪ ، 78٪ -89٪) و حساسیت 81٪ بود. (95٪ CI ، 67٪ -100٪). Notably, in both cases, the sensitivity declined substantially when the fraction of dd-cfDNA exceeded 3%. قابل توجه است که در هر دو مورد ، وقتی که کسری از dd-cfDNA از 3٪ بیشتر شد ، این حساسیت کاهش می یابد.
To improve specificity and sensitivity of a non-invasive cfDNA-based assay to detect rejection following renal transplantation, investigators also have surveyed the absolute amount of dd-cfDNA (32-33). برای بهبود ویژگی و حساسیت یک روش مبتنی بر cfDNA غیر تهاجمی برای تشخیص رد پس از پیوند کلیه ، محققان همچنین مقدار مطلق dd-cfDNA (33-32) را بررسی کرده اند. By interrogating the absolute amount of dd-cfDNA, one can eliminate the artificial changes in the fraction of dd-cfDNA due to increases in total cfDNA levels caused by non-rejection events, such as infection, trauma, or exercise, potentially creating a more accurate assay. با بازجویی از مقدار مطلق dd-cfDNA ، می توان تغییرات مصنوعی در کسری از dd-cfDNA را ناشی از افزایش سطح کل cfDNA ناشی از وقایع عدم رد مانند عفونت ، تروما یا ورزش از بین برد ، به طور بالقوه ایجاد بیشتر روش دقیق
To investigate this possibility, one study employed 32 informative copy number variants (CNVs) based on population frequencies, as opposed to relative proportions of donor and recipient SNPs at given loci (32). برای بررسی این احتمال ، در یک مطالعه 32 نوع نسخه کپی آگاهانه (CNV) بر اساس فرکانس جمعیت ، بر خلاف نسبت های نسبی SNP های اهدا کننده و گیرنده در محل مورد نظر (32) استفاده شده است. All CNVs not present within a recipient's genome but present within the extracted cfDNA were therefore assumed to represent dd-cfDNA. تمام CNV های موجود در ژنوم گیرنده اما موجود در cfDNA استخراج شده از این رو فرض بر این است که نشان دهنده dd-cfDNA است.
Interestingly, while the specificity and sensitivity improved overall with the use of absolute dd-cfDNA levels, this assay also had a greater capacity to distinguish between the presence and absence of active AMR, as opposed to cases of active ACR. جالب توجه است ، در حالی که ویژگی و حساسیت به طور کلی با استفاده از سطح dd-cfDNA مطلق بهبود یافته است ، این روش همچنین ظرفیت بیشتری برای تمایز بین حضور و عدم حضور AMR فعال دارد ، بر خلاف موارد ACR فعال. In addition, serum creatinine levels were not sufficient in discriminating between active rejection and quiescence, likely because it is more indicative of glomerular function as opposed to kidney tissue damage (31-33). علاوه بر این ، سطح کراتینین سرم در تمایز بین رد فعال و ترک آن کافی نیست ، به احتمال زیاد به دلیل این که نشان دهنده عملکرد گلومرولی بیشتر از آسیب بافت کلیه است (33-31).
Another study explored the absolute levels of dd-cfDNA in kidney transplant recipients related to levels of tacrolimus, an immunosuppressant (33). مطالعه دیگری به بررسی سطح مطلق dd-cfDNA در گیرندگان پیوند کلیه مربوط به سطح تاکرولیموس ، یک سرکوب کننده سیستم ایمنی (33). Here, the researchers found that the absolute amount of dd-cfDNA was substantially higher in patients with lower tacrolimus levels (<8 μg/L) in comparison to those with higher drug levels. در اینجا ، محققان دریافتند که مقدار مطلق dd-cfDNA در بیماران با سطح تاکرولیموس پایین تر (<8 میکروگرم بر لیتر) در مقایسه با کسانی که سطح داروی بالاتری دارند ، بیشتر بود. These data suggest that dd-cfDNA levels also have the potential to detect allograft injury resulting from inadequate immunosuppression. این داده ها نشان می دهد که سطح dd-cfDNA همچنین پتانسیل شناسایی آسیب آلوگرافت ناشی از سرکوب سیستم ایمنی ناکافی را دارد.
Laboratories also have proposed alternatives to WGS. آزمایشگاهها همچنین گزینه های WGS را پیشنهاد داده اند. Our group explored targeted sequencing of 124 highly polymorphic (minor allele frequency [MAF] >0.4) SNPs using a commercially available panel, next-generation sequencing, and a novel algorithm (34). گروه ما توالی هدفمند از 124 SNP های بسیار پلی مورفیک (فرکانس آللی جزئی [MAF]> 0.4) SNP را با استفاده از یک پانل تجاری در دسترس ، توالی نسل بعدی و یک الگوریتم رمان (34) مورد بررسی قرار داد. This approach significantly reduced the total amount of sequencing required, decreasing costs and assay time, and enabling rapid analysis. این روش به طور قابل توجهی باعث کاهش مقدار کل توالی بندی مورد نیاز ، کاهش هزینه ها و زمان سنجش و تجزیه و تحلیل سریع می شود. However, since this assay relies upon differences in MAF between individuals, it would not be robust for closely related donor–recipient pairs, such as seen in living-related kidney donation. با این حال ، از آنجا که این روش به تفاوت های MAF بین افراد متکی است ، برای زوج های دهنده دهنده گیرنده نزدیک ، مانند آنچه در اهدای کلیه مرتبط با زندگی دیده می شود ، قوی نخواهد بود. It remains to be validated for detecting moderate or greater rejection events. باقیمانده است که برای شناسایی حوادث رد یا اعتراض متوسط ​​یا بیشتر تأیید شود.
Laboratories also have explored using polymorphic SNPs to quantify dd-cfDNA combined with the technology of digital droplet PCR (30,35-37). آزمایشگاهها همچنین با استفاده از SNP های چندشکلی برای تعیین کمیت dd-cfDNA همراه با فناوری قطرات دیجیتال PCR (30-35-37) تحقیق کرده اند. Using 41 highly polymorphic SNPs, stable kidney and HT recipients showed dd-cfDNA fractions of 2%–3% with stable liver transplant recipients having a level of 7% (35). با استفاده از 41 SNP بسیار پلی مورفیک ، گیرنده های کلیوی و HT با ثبات ، کسرهای dd-cfDNA را از 2٪ -3٪ با گیرنده های پیوند کبد پایدار که سطح 7٪ دارند نشان داد.
نتیجه گیری
The use of a costly and invasive tissue biopsy to detect allograft rejection has significant limitations. استفاده از بیوپسی بافت پرهزینه و تهاجمی برای تشخیص رد آلوگرافت محدودیتهای قابل توجهی دارد. As such, a minimally invasive assay that can directly and accurately assess the health of the entire transplanted organ represents a holy grail in solid organ transplantation. به این ترتیب ، یک روش با حداقل تهاجمی که می تواند به طور مستقیم و دقیق سلامت کل ارگان پیوند را ارزیابی کند ، نشانگر یک قبر مقدس در پیوند اعضای بدن است.
The use of cfDNA after transplantation has shown some initial promise, but further study and validation is required to improve our understanding of both the basic biology of cfDNA as well as its behavior post-transplant. استفاده از cfDNA پس از پیوند برخی از وعده های اولیه را نشان داده است ، اما مطالعه و اعتبار سنجی بیشتر برای بهبود درک ما در مورد زیست شناسی اساسی cfDNA و همچنین رفتار پس از پیوند لازم است. At this time, it is clear that important organ-specific differences exist, and patterns of cfDNA release may also differ depending on the type of rejection event. در این زمان ، واضح است که تفاوتهای مهم در ارگانها وجود دارد ، و الگوهای انتشار cfDNA نیز بسته به نوع رویداد رد ممکن است متفاوت باشد. However, cfDNA represents one of the most promising technologies yet developed to complement or even ultimately replace the tissue biopsy. با این حال ، cfDNA یکی از امیدوارکننده ترین فن آوری است که هنوز برای تکمیل یا حتی در نهایت جایگزینی بیوپسی بافت ایجاد شده است.